DB22T 2050-2014 动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光PCR方法
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0.21 |
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日期： |
2018-3-12 |
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ICS 65.120,B 46,备案号：41838-2014 DB22,吉林省地方标准,DB 22/T 2050—2014,动物源性饲料中猪源性成分测定,实时荧光PCR方法,Determination of porcine derived materials in animal-originated feedstuffs,Real-time PCR method,2014 - 02 - 28 发布 2014 - 04 - 30 实施,吉林省质量技术监督局 发布,DB22/T 2050—2014,I,前 言,本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草,本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口,本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华,人民共和国吉林出入境检验检疫局,本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖,DB22/T 2050—2014,1,动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光PCR方法,1 范围,本标准规定了动物源性饲料中猪源性成分的实时荧光PCR检验方法，该方法的检出限为0.1%,本标准适用于动物源性饲料中猪源性成分的定性检测,2 规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1,猪源性成分 porcine -derived materials,猪种属特异性DNA 片段,3.2,实时荧光PCR real time PCR,实时荧光聚合酶链式反应,3.3,Ct值 cycle threshold value,每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数,4 原理,对样品进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，检测饲料中猪源性,成分,5 试剂,除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA,酶污染的容器分装,DB22/T 2050—2014,2,5.1 引物和探针,a) 上游引物：5’- CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’,b) 下游引物：5’- TGCCAAGCGGGTTGCT-3’,c) 探针：FAM- CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA –TAMRA,5.2 Taq DNA 聚合酶,5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine,triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）,5.4 动物基因组DNA 提取纯化试剂盒,5.5 RNase A 酶：冻干品，不含DNase,5.6 蛋白酶K：冻干品,5.7 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂,5.8 Tris饱和苯酚,5.9 三羟甲基氨基甲烷（Tris）,5.10 三水合乙酸钠、氯化钠,5.11 十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide，CTAB）,5.12 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na22H2O）,5.13 10×PCR 缓冲液：含200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L氯,化镁（MgCl2）,5.14 RNase A酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解RNase A酶为10 g/L的溶液，分装后于-20 ℃保存,避免反复冻融,5.15 蛋白酶K溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶K 为20 mg/mL的溶液，分装后于-20 ℃保存,避免反复冻融,5.16 乙酸钠溶液，3 mol/L：在80 mL水中，加入40.81 g 三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值,到5.2，用水定容到100 mL，分装后高压灭菌,5.17 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在800 mL去离子水中溶解121.1 g Tris，冷却至室温后用浓盐酸调节,溶液的pH 值至8.0，加水定容至1 L，分装后高压灭菌,5.18 EDTA，0.5 mol/L，pH8.0：称取186.1 g EDTA-Na22H2O，加入700 mL水中，在磁力搅拌器上,剧烈搅拌，用10 mol/L氢氧化钠调pH 值至8.0，用水定容到1 L，分装后高压灭菌,5.19 CTAB 提取缓冲液I：在800 mL去离子水中加入46.75 g氯化钠，溶解后加入1 mol/L Tris-HCl,（pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10 mol/L氢氧化钠,调节溶液的pH 值至8.0，用水定容至1 L，分装后高压灭菌,5.20 CTAB 提取缓冲液II：在800 mL去离子水中加入46.75 g氯化钠，20 g CTAB，完全溶解后加入,1 mol/L Tris-HCl （pH8.0）50mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用水定容至1 L，分装后高压灭菌,5.21 Tr……
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